ELISA

Bezpośredni test ELISA

Bezpośredni test ELISA polega na bezpośrednim wykrywaniu antygenu unieruchomionego na mikropłytce przy użyciu enzymatycznie związanego przeciwciała specyficznego dla antygenu. Metoda ta jest prosta i szybka, zmniejszając liczbę etapów i potencjalnych błędów. Chociaż zapewnia szybkie wyniki, może mieć niższą czułość w porównaniu z innymi typami ELISA. W testach bezpieczeństwa żywności bezpośredni test ELISA jest przydatny do szybkiego badania przesiewowego określonych patogenów przenoszonych przez żywność lub alergenów w prostych próbkach. Oto proces krok po kroku:

1. Powlekanie antygenem: Docelowy antygen (taki jak alergen lub toksyna) jest bezpośrednio dodawany do dołków mikropłytki. Antygen wiąże się z powierzchnią płytki poprzez adsorpcję. Ten etap zapewnia unieruchomienie antygenu w celu jego wykrycia. Następnie dołki są płukane w celu usunięcia niezwiązanego antygenu lub zanieczyszczeń. Do dołków dodawany jest roztwór blokujący zawierający niereaktywne białko (takie jak albumina surowicy bydlęcej lub kazeina). Ten etap pokrywa każdą niepowleczoną powierzchnię płytki, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z płytką, co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników.
2. Dodanie przeciwciała sprzężonego z enzymem: Do dołków dodawane jest specyficzne przeciwciało sprzężone z enzymem. Przeciwciało to jest zaprojektowane tak, aby wiązać się bezpośrednio z unieruchomionym antygenem na płytce. Następnie płytka jest ponownie płukana w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał sprzężonych z enzymem, co zapobiega niespecyficznemu generowaniu sygnału.
3. Pomiar sygnału: Do studzienek dodawany jest substrat, który reaguje z enzymem przyłączonym do przeciwciała, wytwarzając mierzalny sygnał, zazwyczaj zmianę koloru. Intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do ilości antygenu obecnego w próbce.

Pośredni test ELISA

Pośredni test ELISA dodaje warstwę wzmocnienia poprzez zastosowanie pierwotnego przeciwciała specyficznego dla antygenu i znakowanego przeciwciała wtórnego, które wiąże się z pierwotnym przeciwciałem. Zwiększa to czułość i elastyczność testu, umożliwiając wykrywanie celów o niskiej liczebności. Jest to szczególnie korzystne w przypadku wykrywania zanieczyszczeń żywności i jest szeroko stosowane w laboratoriach bezpieczeństwa żywności do monitorowania higieny i wykrywania patogenów w złożonych matrycach żywności.

1. Powłoka antygenowa: Docelowy antygen (taki jak alergen lub patogen) jest dodawany do dołków mikropłytki i wiąże się z powierzchnią poprzez adsorpcję. Ten etap unieruchamia antygen do wykrywania. Następnie dołki są płukane w celu usunięcia niezwiązanego antygenu lub zanieczyszczeń. Roztwór blokujący zawierający niereaktywne białko (np. albuminę surowicy bydlęcej lub kazeinę) jest dodawany w celu pokrycia wszelkich niepokrytych obszarów dołków. Zapobiega to niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z płytką, zmniejszając szum tła w teście.
2. Dodanie przeciwciała pierwotnego: Do dołków dodawane jest pierwotne przeciwciało specyficzne dla antygenu. Przeciwciało to wiąże się z unieruchomionym antygenem. Nie jest ono związane z enzymem, ale tworzy pierwszą warstwę w procesie wykrywania. Studzienki są przemywane w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał pierwotnych, zapewniając, że pozostaną tylko przeciwciała związane z antygenem.
3. Dodanie przeciwciała drugorzędowego: Dodawane jest przeciwciało drugorzędowe, które jest sprzężone z enzymem. To przeciwciało jest specyficzne dla pierwotnego przeciwciała i wiąże się z nim. Przeciwciało wtórne wzmacnia sygnał, ponieważ wiele przeciwciał wtórnych może wiązać się z pojedynczym przeciwciałem pierwotnym, zwiększając czułość testu. Po związaniu płytka jest ponownie płukana w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych, zapewniając czysty i specyficzny sygnał.
4. Pomiar sygnału: Dodawany jest substrat, który reaguje z enzymem związanym z przeciwciałem drugorzędowym. Reakcja ta wytwarza mierzalny sygnał, taki jak zmiana koloru. Intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do ilości antygenu obecnego w próbce.

Test kanapkowy ELISA

Sandwich ELISA wykorzystuje dwa przeciwciała, które wiążą się z antygenem w różnych epitopach, skutecznie go "kanapkując". Metoda ta oferuje wysoką specyficzność i czułość, dzięki czemu idealnie nadaje się do wykrywania alergenów pokarmowych w niskich stężeniach. Firmy produkujące żywność wykorzystują metodę kanapkową ELISA, aby zapewnić, że ich produkty są wolne od szkodliwych substancji, zgodnie z surowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa żywności. Proces w szczegółach:

1. Powlekanie przeciwciałami: Proces rozpoczyna się od pokrycia dołków mikropłytki specyficznym przeciwciałem wychwytującym. Przeciwciało to jest przeznaczone do wiązania się z określonym antygenem (cząsteczką docelową) znajdującym się w próbce żywności. Następnie dołki są płukane w celu usunięcia niezwiązanego antygenu lub zanieczyszczeń. Dodawany jest roztwór blokujący zawierający niereaktywne białko (takie jak albumina surowicy bydlęcej lub kazeina). Pokrywa to każdą niepowleczoną powierzchnię płytki, zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z płytką, co może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników.
2. Dodanie próbki: Próbka (taka jak ekstrakt spożywczy) jest dodawana do dołków. Jeśli antygen będący przedmiotem zainteresowania (taki jak alergen) jest obecny w próbce, zwiąże się on z przeciwciałem wychwytującym unieruchomionym na płytce. Następnie płytka jest płukana w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych substancji. Ten krok zapewnia, że tylko docelowy antygen pozostaje w studzience.
3. Wiązanie przeciwciała wykrywającego: Następnie dodawane jest przeciwciało wykrywające. To przeciwciało jest również specyficzne dla antygenu, ale wiąże się z innym miejscem (epitopem) na antygenie niż przeciwciało wychwytujące. Przeciwciało wykrywające jest zazwyczaj połączone z enzymem.
4. Pomiar sygnału: Po związaniu przeciwciała wykrywającego płytka jest ponownie płukana w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych przeciwciał. Następnie dodawany jest roztwór substratu, który reaguje z enzymem związanym z przeciwciałem wykrywającym, wytwarzając mierzalny sygnał (zwykle zmianę koloru). Intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do ilości antygenu docelowego obecnego w próbce.

Konkurencyjny test ELISA

W konkurencyjnym teście ELISA antygen próbki i znakowany antygen konkurują o wiązanie z ograniczoną ilością przeciwciała. Ten format jest przydatny do wykrywania małych cząsteczek i toksyn, gdzie dwa przeciwciała nie mogą wiązać się jednocześnie ze względu na ograniczenia wielkości. Jest on powszechnie stosowany do pomiaru pestycydów, mikotoksyn i innych małych zanieczyszczeń w próbkach żywności. Metoda ta jest cenna dla laboratoriów testujących bezpieczeństwo żywności, koncentrujących się na wykrywaniu substancji o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia. Oto jak działa ten proces:

1. Reakcja przeciwciała i próbki: Próbka zawierająca docelowy antygen jest mieszana ze specyficznymi przeciwciałami pierwotnymi, które zostały zaprojektowane do wiązania się z tym antygenem. Gdy przeciwciała reagują z wolnym antygenem, powstają kompleksy antygen-przeciwciało. Studzienki są następnie płukane w celu usunięcia niepożądanych składników.
2. Wiązanie niezwiązanego przeciwciała: Mieszanina jest następnie dodawana do mikropłytki ze studzienkami wstępnie pokrytymi tym samym antygenem. Tylko niezwiązane przeciwciała pierwotne (te, które nie są związane z antygenem w próbce) mogą przyłączyć się do antygenu na płytce, stąd "konkurencja". Po odczekaniu czasu na związanie, płytka jest płukana w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych składników, zapewniając, że pozostaną tylko przeciwciała związane z płytką.
3. Wiązanie przeciwciał wtórnych: Po przemyciu dodawane jest przeciwciało wtórne związane z enzymem. To przeciwciało drugorzędowe wiąże się specyficznie z przeciwciałem pierwszorzędowym, które jest związane z antygenem na płytce.
4. Pomiar sygnału: Na koniec wprowadzany jest substrat, który reaguje z enzymem połączonym z przeciwciałem drugorzędowym, wytwarzając mierzalny sygnał (taki jak zmiana koloru). Intensywność sygnału jest odwrotnie proporcjonalna do ilości docelowego antygenu w próbce. Oznacza to, że im więcej antygenu znajduje się w próbce, tym mniej wolnych przeciwciał jest dostępnych do związania z płytką, co skutkuje słabszym sygnałem.