ELISA

ELISA directo

El ELISA directo consiste en la detección directa de un antígeno inmovilizado en una microplaca mediante un anticuerpo ligado a la enzima específico del antígeno. Este método es sencillo y rápido, lo que reduce el número de pasos y los posibles errores. Aunque ofrece resultados rápidos, puede tener una sensibilidad menor en comparación con otros tipos de ELISA. En las pruebas de seguridad alimentaria, el ELISA directo es útil para la detección rápida de patógenos o alérgenos específicos transmitidos por los alimentos en muestras simples. He aquí el proceso paso a paso:

1. Recubrimiento del antígeno: El antígeno diana (como un alérgeno o una toxina) se añade directamente a los pocillos de una microplaca. El antígeno se une a la superficie de la placa mediante adsorción. Este paso garantiza la inmovilización del antígeno para su detección. A continuación se lavan los pocillos para eliminar cualquier antígeno no unido o restos. Se añade a los pocillos una solución de bloqueo que contenga una proteína no reactiva (como albúmina de suero bovino o caseína). Este paso cubre cualquier superficie no recubierta de la placa, evitando la unión inespecífica de los anticuerpos a la placa, lo que podría dar lugar a resultados falsos positivos.
2. Adición de anticuerpos conjugados con enzimas: Se añade a los pocillos un anticuerpo específico ligado a enzimas. Este anticuerpo está diseñado para unirse directamente al antígeno inmovilizado en la placa. A continuación, la placa se lava de nuevo para eliminar cualquier anticuerpo conjugado con enzimas que no se haya unido, evitando así la generación de señales no específicas.
3. Medición de la señal: Se añade un sustrato a los pocillos, que reacciona con la enzima unida al anticuerpo, produciendo una señal medible, normalmente un cambio de color. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.

ELISA indirecto

El ELISA indirecto añade una capa de amplificación mediante el uso de un anticuerpo primario específico del antígeno y un anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo primario. Esto aumenta la sensibilidad y flexibilidad del ensayo, permitiendo la detección de objetivos de baja abundancia. Es especialmente beneficioso para detectar contaminantes alimentarios y se utiliza ampliamente en los laboratorios de seguridad alimentaria para controlar la higiene y detectar patógenos en matrices alimentarias complejas.

1. Recubrimiento de antígeno: El antígeno diana (como un alérgeno o un patógeno) se añade a los pocillos de una microplaca y se une a la superficie mediante adsorción. Este paso inmoviliza el antígeno para su detección. A continuación se lavan los pocillos para eliminar cualquier antígeno no unido o restos. Se añade una solución de bloqueo que contenga una proteína no reactiva (por ejemplo, albúmina de suero bovino o caseína) para cubrir cualquier zona no recubierta de los pocillos. Esto evita la unión inespecífica de los anticuerpos a la placa, reduciendo el ruido de fondo en el ensayo.
2. Adición de anticuerpos primarios: Se añade a los pocillos un anticuerpo primario específico del antígeno. Este anticuerpo se une al antígeno inmovilizado. No está ligado a enzimas pero forma la primera capa en el proceso de detección. Los pocillos se lavan para eliminar cualquier anticuerpo primario no unido, asegurando que sólo queden anticuerpos unidos al antígeno.
3. Adición de anticuerpos secundarios: Se añade un anticuerpo secundario conjugado con enzimas. Este anticuerpo es específico del anticuerpo primario y se une a él. El anticuerpo secundario amplifica la señal, ya que varios anticuerpos secundarios pueden unirse a un único anticuerpo primario, lo que aumenta la sensibilidad del ensayo. Tras la unión, la placa se lava de nuevo para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos, lo que garantiza una señal limpia y específica.
4. Medición de la señal: Se añade un sustrato, que reacciona con la enzima unida al anticuerpo secundario. Esta reacción produce una señal medible, como un cambio de color. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.

ELISA en sándwich

El ELISA en sándwich emplea dos anticuerpos que se unen al antígeno en diferentes epítopos, "emparedándolo" de forma efectiva. Este método ofrece una gran especificidad y sensibilidad, por lo que es ideal para detectar alérgenos alimentarios en bajas concentraciones. Las empresas productoras de alimentos utilizan el ELISA en sándwich para garantizar que sus productos están libres de sustancias nocivas, cumpliendo así las estrictas normas de seguridad alimentaria. El proceso en detalle:

1. Recubrimiento de anticuerpos: El proceso comienza recubriendo los pocillos de la microplaca con un anticuerpo de captura específico. Este anticuerpo está diseñado para unirse a un antígeno concreto (la molécula diana) que se encuentra en la muestra alimentaria. A continuación se lavan los pocillos para eliminar cualquier antígeno no unido o restos. Se añade una solución de bloqueo que contiene una proteína no reactiva (como la albúmina de suero bovino o la caseína). Esto cubre cualquier superficie no recubierta de la placa, evitando la unión inespecífica de anticuerpos a la placa, lo que podría dar lugar a resultados falsos positivos.
2. Adición de la muestra: La muestra (como un extracto alimentario) se añade a los pocillos. Si el antígeno de interés (como un alérgeno) está presente en la muestra, se unirá al anticuerpo de captura inmovilizado en la placa. A continuación se lava la placa para eliminar cualquier sustancia no unida. Este paso garantiza que sólo el antígeno diana permanezca en el pocillo.
3. Unión del anticuerpo de detección: A continuación, se añade un anticuerpo de detección. Este anticuerpo también es específico del antígeno, pero se une a un sitio diferente (epítopo) en el antígeno que el anticuerpo de captura. El anticuerpo de detección suele estar unido a una enzima.
4. Medición de la señal: Tras la unión del anticuerpo de detección, la placa se lava de nuevo para eliminar cualquier exceso de anticuerpos no unidos. A continuación se añade una solución de sustrato, que reacciona con la enzima unida al anticuerpo de detección, produciendo una señal medible (normalmente un cambio de color). La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de antígeno diana presente en la muestra.

ELISA competitivo

En el ELISA competitivo, el antígeno de la muestra y un antígeno marcado compiten por unirse a una cantidad limitada de anticuerpo. Este formato es útil para detectar moléculas pequeñas y toxinas en las que dos anticuerpos no pueden unirse simultáneamente debido a limitaciones de tamaño. Se utiliza habitualmente para medir pesticidas, micotoxinas y otros contaminantes pequeños en muestras de alimentos. Este método es valioso para los laboratorios de pruebas de seguridad alimentaria que se centran en la detección de sustancias de bajo peso molecular que podrían plantear riesgos para la salud. He aquí cómo funciona el proceso:

1. Reacción del anticuerpo y la muestra: La muestra, que contiene el antígeno objetivo, se mezcla con anticuerpos primarios específicos diseñados para unirse a ese antígeno. A medida que los anticuerpos reaccionan con el antígeno libre, se forman complejos antígeno-anticuerpo. A continuación se lavan los pocillos para eliminar los componentes no deseados.
2. Unión de anticuerpos no unidos: La mezcla se añade a continuación a una microplaca con pocillos precubiertos con el mismo antígeno. Sólo los anticuerpos primarios no unidos (los que no están unidos al antígeno de la muestra) pueden unirse al antígeno de la placa, de ahí la "competición". Tras dejar tiempo para la unión, se lava la placa para eliminar los componentes no unidos, asegurando que sólo queden anticuerpos unidos a la placa.
3. Unión del anticuerpo secundario: Tras el lavado, se añade un anticuerpo secundario unido a una enzima. Este anticuerpo secundario se une específicamente al anticuerpo primario que está unido al antígeno de la placa.
4. Medición de la señal: Por último, se introduce un sustrato, que reacciona con la enzima unida al anticuerpo secundario, produciendo una señal medible (como un cambio de color). La intensidad de la señal es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno diana en la muestra. Esto significa que cuanto más antígeno esté presente en la muestra, menos anticuerpos libres estarán disponibles para unirse a la placa, lo que producirá una señal más débil.