ELISA

ELISA direto

O ELISA direto envolve a detecção direta de um antígeno imobilizado em uma microplaca usando um anticorpo ligado à enzima específico para o antígeno. Esse método é simples e rápido, reduzindo o número de etapas e possíveis erros. Embora ofereça resultados rápidos, ele pode ter uma sensibilidade menor em comparação com outros tipos de ELISA. Nos testes de segurança alimentar, o ELISA direto é útil para a triagem rápida de patógenos ou alérgenos específicos de origem alimentar em amostras simples. Veja a seguir o processo passo a passo:

1. Revestimento do antígeno: O antígeno alvo (como um alérgeno ou toxina) é adicionado diretamente aos poços de uma microplaca. O antígeno se liga à superfície da placa por adsorção. Essa etapa garante que o antígeno seja imobilizado para detecção. Em seguida, os poços são lavados para remover qualquer antígeno não ligado ou detritos. Uma solução de bloqueio contendo uma proteína não reativa (como albumina de soro bovino ou caseína) é adicionada aos poços. Essa etapa cobre qualquer superfície não revestida da placa, evitando a ligação não específica de anticorpos à placa, o que poderia levar a resultados falso-positivos.
2. Adição de anticorpo conjugado com enzima: Um anticorpo específico ligado à enzima é adicionado aos poços. Esse anticorpo é projetado para se ligar diretamente ao antígeno imobilizado na placa. Em seguida, a placa é lavada novamente para remover qualquer anticorpo conjugado com enzima não ligado, evitando a geração de sinal não específico.
3. Medição do sinal: Um substrato é adicionado aos poços, que reage com a enzima ligada ao anticorpo, produzindo um sinal mensurável, normalmente uma mudança de cor. A intensidade do sinal é diretamente proporcional à quantidade de antígeno presente na amostra.

ELISA indireto

O ELISA indireto acrescenta uma camada de amplificação ao usar um anticorpo primário específico para o antígeno e um anticorpo secundário marcado que se liga ao anticorpo primário. Isso aumenta a sensibilidade e a flexibilidade do ensaio, permitindo a detecção de alvos de baixa abundância. É particularmente benéfico para a detecção de contaminantes alimentares e é amplamente utilizado em laboratórios de segurança alimentar para monitorar a higiene e detectar patógenos em matrizes alimentares complexas.

1. Revestimento de antígeno: O antígeno alvo (como um alérgeno ou patógeno) é adicionado aos poços de uma microplaca e se liga à superfície por meio de adsorção. Essa etapa imobiliza o antígeno para detecção. Em seguida, os poços são lavados para remover qualquer antígeno não ligado ou detritos. Uma solução de bloqueio contendo uma proteína não reativa (por exemplo, albumina de soro bovino ou caseína) é adicionada para cobrir todas as áreas não revestidas dos poços. Isso evita a ligação não específica de anticorpos à placa, reduzindo o ruído de fundo no ensaio.
2. Adição de anticorpo primário: Um anticorpo primário específico para o antígeno é adicionado aos poços. Esse anticorpo se liga ao antígeno imobilizado. Ele não é ligado a enzimas, mas forma a primeira camada no processo de detecção. Os poços são lavados para remover qualquer anticorpo primário não ligado, garantindo que apenas os anticorpos ligados ao antígeno permaneçam.
3. Adição de anticorpo secundário: É adicionado um anticorpo secundário conjugado a uma enzima. Esse anticorpo é específico para o anticorpo primário e se liga a ele. O anticorpo secundário amplifica o sinal, pois vários anticorpos secundários podem se ligar a um único anticorpo primário, aumentando a sensibilidade do ensaio. Após a ligação, a placa é lavada novamente para remover os anticorpos secundários não ligados, garantindo um sinal limpo e específico.
4. Medição do sinal: Um substrato é adicionado, reagindo com a enzima ligada ao anticorpo secundário. Essa reação produz um sinal mensurável, como uma mudança de cor. A intensidade do sinal é diretamente proporcional à quantidade de antígeno presente na amostra.

ELISA em sanduíche

O ELISA sanduíche emprega dois anticorpos que se ligam ao antígeno em epítopos diferentes, efetivamente "sanduícheando-o". Esse método oferece alta especificidade e sensibilidade, tornando-o ideal para a detecção de alérgenos alimentares em baixas concentrações. As empresas de produção de alimentos utilizam o ELISA sanduíche para garantir que seus produtos estejam livres de substâncias nocivas, cumprindo as rigorosas normas de segurança alimentar. O processo em detalhes:

1. Revestimento de anticorpos: O processo começa com o revestimento dos poços da microplaca com um anticorpo de captura específico. Esse anticorpo é projetado para se ligar a um antígeno específico (a molécula alvo) encontrado na amostra de alimento. Em seguida, os poços são lavados para remover qualquer antígeno não ligado ou detritos. É adicionada uma solução de bloqueio contendo uma proteína não reativa (como albumina de soro bovino ou caseína). Isso cobre qualquer superfície não revestida da placa, evitando a ligação não específica de anticorpos à placa, o que poderia levar a resultados falso-positivos.
2. Adição de amostra: A amostra (como um extrato de alimento) é adicionada aos poços. Se o antígeno de interesse (como um alérgeno) estiver presente na amostra, ele se ligará ao anticorpo de captura imobilizado na placa. Em seguida, a placa é lavada para remover quaisquer substâncias não ligadas. Essa etapa garante que apenas o antígeno alvo permaneça no poço.
3. Ligação do anticorpo de detecção: Em seguida, é adicionado um anticorpo de detecção. Esse anticorpo também é específico para o antígeno, mas se liga a um local diferente (epítopo) no antígeno do que o anticorpo de captura. Em geral, o anticorpo de detecção é ligado a uma enzima.
4. Medição do sinal: Depois que o anticorpo de detecção se liga, a placa é lavada novamente para remover qualquer excesso de anticorpos não ligados. Em seguida, é adicionada uma solução de substrato, que reage com a enzima ligada ao anticorpo de detecção, produzindo um sinal mensurável (geralmente uma mudança de cor). A intensidade do sinal é diretamente proporcional à quantidade de antígeno-alvo presente na amostra.

ELISA competitivo

No ELISA competitivo, o antígeno da amostra e um antígeno marcado competem pela ligação a uma quantidade limitada de anticorpo. Esse formato é útil para detectar pequenas moléculas e toxinas em que dois anticorpos não podem se ligar simultaneamente devido a restrições de tamanho. É comumente usado para medir pesticidas, micotoxinas e outros pequenos contaminantes em amostras de alimentos. Esse método é valioso para laboratórios de testes de segurança alimentar que se concentram na detecção de substâncias de baixo peso molecular que podem representar riscos à saúde. Veja a seguir como o processo funciona:

1. Reação do anticorpo e da amostra: A amostra, que contém o antígeno-alvo, é misturada com anticorpos primários específicos projetados para se ligarem a esse antígeno. À medida que os anticorpos reagem com o antígeno livre, formam-se complexos antígeno-anticorpo. Em seguida, os poços são lavados para remover os componentes indesejados.
2. Ligação de anticorpos não ligados: A mistura é então adicionada a uma microplaca com poços pré-revestidos com o mesmo antígeno. Somente os anticorpos primários não ligados (aqueles não ligados ao antígeno na amostra) podem se ligar ao antígeno na placa, daí a "competição". Depois de dar tempo para a ligação, a placa é lavada para remover quaisquer componentes não ligados, garantindo que apenas os anticorpos ligados à placa permaneçam.
3. Ligação de anticorpo secundário: Após a lavagem, é adicionado um anticorpo secundário ligado a uma enzima. Esse anticorpo secundário se liga especificamente ao anticorpo primário que está ligado ao antígeno na placa.
4. Medição do sinal: Por fim, é introduzido um substrato, que reage com a enzima ligada ao anticorpo secundário, produzindo um sinal mensurável (como uma mudança de cor). A intensidade do sinal é inversamente proporcional à quantidade de antígeno-alvo na amostra. Isso significa que quanto mais antígeno estiver presente na amostra, menos anticorpos livres estarão disponíveis para se ligarem à placa, resultando em um sinal mais fraco.