Ukryte ryzyko częściowej inhibicji: Dlaczego niektóre produkty spożywcze maskują salmonellę i inne patogeny?

Co powoduje fałszywie ujemne wyniki testów PCR?

Testy PCR zostały stworzone z myślą o precyzji. Czasami jednak sama żywność staje na przeszkodzie. Składniki takie jak kakao, masło orzechowe, przyprawy i inne złożone matryce zawierają tłuszcze, białka i polifenole, które zakłócają amplifikację, utrudniając wykrycie patogenów. Substancje te mogą osłabiać sygnał PCR, zwłaszcza w połączeniu z niskim poziomem zanieczyszczenia. W takim przypadku test może dać wynik negatywny, mimo że patogen jest nadal obecny.

Dla producentów zajmujących się niektórymi produktami gotowymi do spożycia lub o niskiej wilgotności, to ciche ryzyko ma znaczenie. Nawet pojedyncza komórka Salmonelli w suchym produkcie może utrzymywać się przez wiele miesięcy, powodując problemy na dalszych etapach produkcji przez długi czas po wstępnym teście. Rodzi to ważne pytanie dla każdego programu bezpieczeństwa żywności:

Czy można ufać negatywnym wynikom i co można zrobić zamiast tego?

Zrozumienie częściowej inhibicji

Inhibicja PCR występuje, gdy substancje w próbce żywności zakłócają ekstrakcję lub amplifikację DNA. Związki te mogą wiązać się lub degradować DNA, blokować enzym polimerazy, zmieniać dostępność jonów lub uniemożliwiać spójną ekstrakcję. W takim przypadku reakcja nadal przebiega, ale ilość wykrywalnego DNA jest zmniejszona. Sygnał wydaje się słabszy lub późniejszy niż oczekiwano, co zwiększa ryzyko przeoczenia zanieczyszczenia, które faktycznie jest obecne.

Efekt ten jest subtelny, ale ważny, ponieważ test niekoniecznie kończy się niepowodzeniem; jednak zanieczyszczenie graniczne może już nie osiągać wykrywalnych poziomów. Jest to jedno z najczęstszych źródeł wyników fałszywie ujemnych w żywności złożonej lub o niskiej wilgotności.

Które produkty spożywcze często powodują inhibicję?

Niektóre produkty spożywcze naturalnie zawierają inhibitory ze względu na ich składniki. Na przykład, kakao i czekolada zawierają wysoki poziom tłuszczów i polifenoli. Pasty orzechowe i masło orzechowe zawierają gęste lipidy, które komplikują ekstrakcję. Przyprawy i zioła zawierają polisacharydy, wapń i olejki eteryczne, które spowalniają lub hamują amplifikację. Pokarmy wysokobiałkowe mogą wiązać magnez, który jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania enzymów PCR.

Pomimo różnic, matryce te stwarzają to samo wyzwanie: zmniejszoną wydajność amplifikacji i większą szansę na niewykrycie niskiego poziomu zanieczyszczenia.

Jak wygląda częściowa inhibicja w praktyce?

Większość przypadków inhibicji jest raczej częściowa niż całkowita. Krzywa PCR może nadal się pojawiać, ale zanieczyszczenie graniczne może spaść poniżej progu wykrywalności w trudnych matrycach. W takich przypadkach wyniki mogą wyglądać na czyste, nawet jeśli patogeny pozostają obecne na niskim poziomie, zwłaszcza gdy poziomy zanieczyszczenia są już bardzo niskie.

Dlaczego żywność o niskiej wilgotności stwarza dodatkowe ryzyko?

Żywność o niskiej wilgotności, taka jak kakao, pasty orzechowe, czekolada i proszki, od dawna kojarzona jest z Salmonellą, ale stanowi ona również dodatkowe wyzwanie biologiczne.

Suche środowisko powoduje powstawanie zestresowanych lub uszkodzonych komórek bakteryjnych, które nadal są zdolne do wywoływania chorób. Komórki te regenerują się powoli podczas wzbogacania, co oznacza, że mogą nie osiągnąć wykrywalnych poziomów w ramach czasowych, dla których zaprojektowano test PCR i jego oprogramowanie. Zanieczyszczenia w tych produktach często występują na ułamkowych poziomach, czasami tak niskich jak jedna komórka na sto gramów. Gdy amplifikacja jest już zahamowana, te graniczne wyniki pozytywne znikają jako pierwsze.

Środowiska o niskiej wilgotności również sprzyjają długoterminowemu przetrwaniu. Salmonella może pozostać żywotna przez miesiące, a nawet lata, stanowiąc zagrożenie przez cały okres przechowywania produktu. Gdy zestresowane komórki, niski poziom zanieczyszczenia i inhibicja nakładają się na siebie, prawdopodobieństwo fałszywych wyników ujemnych znacznie wzrasta.

Czym jest dylemat rozcieńczenia?

Jednym z powszechnych sposobów na przezwyciężenie skutków inhibicji jest rozcieńczenie lizatu DNA przed wykonaniem PCR. Zmniejszenie stężenia inhibitorów może poprawić amplifikację. Jednak ten krok zmniejsza również stężenie docelowego DNA. Rozcieńczanie po ekstrakcji może nie być częścią walidacji metody; dlatego laboratoria mogą nieumyślnie wprowadzić utratę czułości w metodzie. W przypadku matryc o niskiej wilgotności, w których Salmonella może już występować na bardzo niskich poziomach, ta utrata czułości może wystarczyć do zmiany słabego wyniku pozytywnego w negatywny.

Czy wtórne wzbogacanie jest lepszym podejściem?

Wtórny etap wzbogacania jest często bardziej niezawodnym rozwiązaniem dla matryc hamujących. W przeciwieństwie do rozcieńczania lizatu, wzbogacanie wtórne może zwiększyć liczbę komórek docelowych, jednocześnie zmniejszając wpływ związków hamujących. Wraz ze wzrostem hodowli, zestresowane komórki odzyskują siły, a substancje hamujące stają się bardziej rozcieńczone w dodatkowej objętości bulionu. Poprawia to ogólną wykrywalność bez pogorszenia czułości.

W przypadku żywności, o której wiadomo, że stanowi wyzwanie dla PCR, takiej jak kakao, czekolada i pasty orzechowe, Hygiena® zapewnia zatwierdzone opcje wtórnego wzbogacania w ramach przepływu pracy. Protokoły te zostały opracowane w celu utrzymania wydajności metody, oferując spójne i sprawdzone podejście do trudnych matryc.

W jaki sposób kontrole wewnętrzne pomagają zapobiegać fałszywym negatywom?

Wewnętrzne kontrole amplifikacji odgrywają kluczową rolę w identyfikacji inhibicji, zanim doprowadzi ona do nieprawidłowego wyniku. System Hygiena BAX® System Q7 i foodproof® zawierają wewnętrzną kontrolę pozytywną w każdej reakcji, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. Jeśli kontrola wewnętrzna nie ulegnie amplifikacji, wynik zostanie oznaczony jako nieokreślony, a nie negatywny. Zapobiega to pomyleniu inhibicji z prawdziwym wynikiem ujemnym i pomaga zapewnić, że wyniki odzwierciedlają rzeczywisty stan próbki.

Test diagnostyczny wykrywający patogeny powinien również potwierdzać, że sama reakcja przebiegła prawidłowo. Kontrole wewnętrzne zapewniają tę pewność i zwiększają zaufanie do prawdziwego wyniku ujemnego.

Dlaczego walidacja ma znaczenie?

Każda żywność zachowuje się inaczej podczas testowania, dlatego niezbędna jest szeroko zakrojona walidacja specyficzna dla matrycy. Organy walidacyjne, takie jak AOAC, ISO, Health Canada, AFNOR, MicroVal i NordVal, wymagają testów w szerokim zakresie rodzajów żywności, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Testy BAX i Foodproof firmy Hygiena zostały zwalidowane pod kątem niskiej wilgotności, wysokiej zawartości tłuszczu, wysokiej zawartości białka i złożonych matryc, aby pomóc laboratoriom zachować zaufanie do wyników wykrywania.

Ten poziom walidacji zapewnia zespołom ds. jakości i audytorom pewność, że negatywne wyniki są znaczące i nie są wynikiem częściowej inhibicji.

Praktyczne kroki w celu zmniejszenia ryzyka inhibicji

Ograniczenie inhibicji zaczyna się od zaufania do stosowanej metody. Laboratoria powinny polegać na w pełni zwalidowanych testach, które są odpowiednie dla testowanych matryc i zapewnić obecność wewnętrznych kontroli w celu automatycznego wykrywania inhibicji. Metody z wtórnym wzbogacaniem są mądrym wyborem dla matryc, o których wiadomo, że stanowią wyzwanie dla ekstrakcji lub amplifikacji. Przygotowanie próbki może również wymagać dostosowania do żywności oleistej, lepkiej lub sproszkowanej.

Kroki te wzmacniają ogólny przepływ pracy i wspierają podejmowanie trafnych decyzji.

Wniosek

Częściowa inhibicja jest niewidocznym czynnikiem w testowaniu patogenów, szczególnie w żywności złożonej lub o niskiej wilgotności. Nie zawsze zatrzymuje chemię, ale może po cichu osłabić sygnał potrzebny do wykrycia niskiego poziomu zanieczyszczenia. Dzięki zwalidowanym metodom PCR, kontrolom wewnętrznym i etapom wzbogacania specyficznym dla matrycy, laboratoria mogą poprawić wiarygodność swoich negatywnych wyników.

W diagnostyce molekularnej dokładność definiuje zarówno pewność, jak i bezpieczeństwo.

Wezwanie do działania

Te matryce stanowią wyzwanie, a ryzyko jest realne. Hygiena oferuje zwalidowane testy BAX System Q7 i testy odporne na żywność, zaprojektowane w celu wspierania dokładnego podejmowania decyzji w przypadku trudnej żywności, komórek poddanych stresowi i niskiego poziomu zanieczyszczenia.

Dzięki odpowiednim narzędziom laboratoria mogą zaufać wynikom, na których polegają każdego dnia.

Często zadawane pytania (FAQ)

P: Co to jest częściowa inhibicja?
Częściowa inhibicja ma miejsce, gdy składniki żywności osłabiają amplifikację PCR, nie powodując pełnego niepowodzenia reakcji.

P: Które produkty spożywcze są najbardziej podatne na inhibicję?
Kakao, czekolada, masła orzechowe, przyprawy, zioła i żywność o wysokiej zawartości tłuszczu lub białka.

P: Czy rozcieńczenie naprawia inhibicję?
Rozcieńczenie może zmniejszyć inhibitory, ale może również zmniejszyć wrażliwość. Może to spowodować, że wyniki graniczne staną się negatywne.

P: Dlaczego zalecane jest wtórne wzbogacenie?
Pomaga zestresowanym komórkom zregenerować się i zmniejsza wpływ inhibitorów bez poświęcania czułości.

P: Jak mogę wykryć inhibicję, zanim spowoduje ona błędy?
Proszę używać testów z wewnętrznymi kontrolami amplifikacji, które oznaczają potencjalne inhibicje.