Das versteckte Risiko der partiellen Inhibition: Warum manche Lebensmittel Salmonellen und andere Krankheitserreger verbergen

Was verursacht falsch negative Ergebnisse bei PCR-Tests?

PCR-Tests sind auf Präzision ausgelegt. Aber manchmal kommen die Lebensmittel selbst in die Quere. Zutaten wie Kakao, Erdnussbutter, Gewürze und andere komplexe Matrices enthalten Fette, Proteine und Polyphenole, die die Amplifikation beeinträchtigen und den Nachweis von Krankheitserregern erschweren. Diese Substanzen können das PCR-Signal abschwächen, insbesondere in Kombination mit einer geringen Kontamination. Wenn das passiert, kann ein Test ein negatives Ergebnis liefern, obwohl der Erreger noch vorhanden ist.

Für Hersteller, die mit bestimmten verzehrfertigen oder feuchtigkeitsarmen Lebensmitteln arbeiten, ist dieses stille Risiko von Bedeutung. Selbst eine einzige Salmonellenzelle in einem trockenen Produkt kann monatelang überleben und noch lange nach dem ersten Test Probleme verursachen. Dies wirft eine wichtige Frage für jedes Lebensmittelsicherheitsprogramm auf:

Können Sie Ihren negativen Ergebnissen trauen und was können Sie stattdessen tun?

Partielle Hemmungen verstehen

Eine PCR-Hemmung tritt auf, wenn Substanzen in einer Lebensmittelprobe die DNA-Extraktion oder -Amplifikation beeinträchtigen. Diese Verbindungen können an die DNA binden oder sie abbauen, das Polymerase-Enzym blockieren, die Verfügbarkeit von Ionen verändern oder eine konsistente Extraktion verhindern. Wenn dies geschieht, läuft die Reaktion zwar weiter, aber die Menge der nachweisbaren DNA ist reduziert. Das Signal erscheint schwächer oder später als erwartet, wodurch sich das Risiko erhöht, eine tatsächlich vorhandene Kontamination zu übersehen.

Dieser Effekt ist subtil, aber wichtig, da der Test nicht zwangsläufig komplett fehlschlägt; dennoch kann es sein, dass eine grenzwertige Kontamination keine nachweisbaren Werte mehr erreicht. Dies ist eine der häufigsten Ursachen für falsch negative Ergebnisse bei komplexen oder feuchtigkeitsarmen Lebensmitteln.

Welche Lebensmittel verursachen in der Regel eine Hemmung?

Einige Lebensmittel enthalten aufgrund ihrer Bestandteile von Natur aus Hemmstoffe. Zum Beispiel, Kakao und Schokolade enthalten einen hohen Anteil an Fetten und Polyphenolen. Nusspasten und Erdnussbutter enthalten dichte Lipide, die die Extraktion erschweren. Gewürze und Kräuter enthalten Polysaccharide, Kalzium und ätherische Öle, die die Verstärkung verlangsamen oder unterdrücken. Eiweißreiche Lebensmittel können Magnesium binden, das für die ordnungsgemäße Funktion der PCR-Enzyme erforderlich ist.

Trotz ihrer Unterschiede stellen diese Matrices die gleiche Herausforderung dar: eine verringerte Amplifikationseffizienz und eine größere Wahrscheinlichkeit, eine geringe Kontamination nicht zu erkennen.

Wie sieht partielle Inhibition in der Praxis aus?

Die meisten Inhibitionsereignisse sind eher partiell als vollständig. Die PCR-Kurve kann immer noch erscheinen, aber eine grenzwertige Kontamination kann in schwierigen Matrices unter die Nachweisgrenze fallen. In diesen Fällen können die Ergebnisse sauber aussehen, obwohl noch geringe Mengen an Krankheitserregern vorhanden sind, insbesondere wenn die Kontamination bereits sehr gering ist.

Warum stellen Lebensmittel mit niedrigem Feuchtigkeitsgehalt ein zusätzliches Risiko dar?

Lebensmittel mit niedrigem Feuchtigkeitsgehalt wie Kakao, Nusspasten, Schokolade und Pulver werden seit langem mit Salmonellen in Verbindung gebracht, aber sie stellen auch zusätzliche biologische Herausforderungen dar.

Eine trockene Umgebung führt zu gestressten oder geschädigten Bakterienzellen, die immer noch in der Lage sind, Krankheiten zu verursachen. Diese Zellen erholen sich während der Anreicherung nur langsam, was bedeutet, dass sie innerhalb des Zeitrahmens, für den der PCR-Test und seine Software konzipiert sind, möglicherweise keine nachweisbaren Werte erreichen. Die Kontamination in diesen Produkten liegt oft nur in Bruchteilen vor, manchmal sogar nur eine Zelle pro hundert Gramm. Wenn die Amplifikation bereits gehemmt ist, sind diese grenzwertig positiven Ergebnisse die ersten, die verschwinden.

Eine feuchtigkeitsarme Umgebung begünstigt auch das langfristige Überleben. Salmonellen können monatelang oder sogar jahrelang lebensfähig bleiben und stellen während der gesamten Haltbarkeitsdauer des Produkts ein Risiko dar. Wenn sich gestresste Zellen, niedrige Kontaminationsniveaus und Hemmungen überschneiden, steigt die Wahrscheinlichkeit von falsch-negativen Ergebnissen erheblich.

Was ist das Dilemma der Verdünnung?

Ein gängiger Ansatz zur Überwindung der Auswirkungen von Inhibitoren ist die Verdünnung des DNA-Lysats vor der Durchführung der PCR. Die Verringerung der Konzentration von Inhibitoren kann die Amplifikation verbessern. Dieser Schritt verringert jedoch auch die Konzentration der Ziel-DNA. Die Verdünnung nach der Extraktion ist möglicherweise nicht Teil einer Methodenvalidierung, so dass Labore unbeabsichtigt einen Verlust an Sensitivität in die Methode einführen können. Bei Matrizen mit niedrigem Feuchtigkeitsgehalt, in denen Salmonellen bereits in extrem niedrigen Konzentrationen vorhanden sein können, kann dieser Empfindlichkeitsverlust ausreichen, um ein schwaches Positiv in ein Negativ zu verwandeln.

Ist die sekundäre Anreicherung ein besserer Ansatz?

Ein sekundärer Anreicherungsschritt ist oft eine zuverlässigere Lösung für inhibitorische Matrizes. Im Gegensatz zur Lysatverdünnung kann die sekundäre Anreicherung die Anzahl der Zielzellen erhöhen und gleichzeitig den Einfluss der hemmenden Verbindungen verringern. Wenn die Kultur wächst, erholen sich die gestressten Zellen und die hemmenden Substanzen werden durch das zusätzliche Brühevolumen stärker verdünnt. Dies verbessert den Gesamtnachweis, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen.

Für Lebensmittel, die bekanntermaßen eine Herausforderung für die PCR darstellen, wie z.B. Kakao, Schokolade und Nusspasten, bietet Hygiena® validierte sekundäre Anreicherungsoptionen als Teil des Arbeitsablaufs. Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Leistungsansprüche der Methode aufrechtzuerhalten und bieten einen konsistenten und validierten Ansatz für anspruchsvolle Matrices.

Wie helfen interne Kontrollen, falsch negative Ergebnisse zu verhindern?

Interne Amplifikationskontrollen spielen eine Schlüsselrolle bei der Identifizierung von Hemmungen, bevor diese zu einem falschen Ergebnis führen. Hygiena's BAX® System Q7 und foodproof® Assays enthalten in jeder Reaktion eine interne Positivkontrolle, um zu bestätigen, dass die Chemie wie erwartet funktioniert. Wenn die interne Kontrolle nicht amplifiziert, wird das Ergebnis als unbestimmt und nicht als negativ markiert. Dadurch wird verhindert, dass eine Hemmung fälschlicherweise für ein echtes Negativ gehalten wird, und es wird sichergestellt, dass die Ergebnisse den tatsächlichen Zustand der Probe widerspiegeln.

Ein diagnostischer Test, der Krankheitserreger nachweist, sollte auch bestätigen, dass die Reaktion selbst funktioniert hat. Interne Kontrollen bieten diese Sicherheit und erhöhen das Vertrauen in ein echtes negatives Ergebnis.

Warum ist die Validierung wichtig?

Jedes Lebensmittel verhält sich beim Testen anders, weshalb eine umfassende matrixspezifische Validierung unerlässlich ist. Validierungsstellen wie AOAC, ISO, Health Canada, AFNOR, MicroVal und NordVal verlangen Tests für eine breite Palette von Lebensmitteln, um eine zuverlässige Leistung zu gewährleisten. Die BAX- und foodproof-Tests von Hygiena® wurden für eine Vielzahl von feuchtigkeitsarmen, fettreichen, proteinreichen und komplexen Matrices validiert, damit die Labors das Vertrauen in ihre Nachweisergebnisse bewahren können.

Dieses Maß an Validierung bietet Qualitätsteams und Prüfern die Gewissheit, dass negative Ergebnisse aussagekräftig und nicht das Ergebnis einer partiellen Hemmung sind.

Praktische Schritte zur Verringerung des Inhibitionsrisikos

Die Verringerung von Hemmungen beginnt mit dem Vertrauen in die verwendete Methode. Labors sollten sich auf vollständig validierte Assays verlassen, die für die getesteten Matrices geeignet sind, und sicherstellen, dass interne Kontrollen vorhanden sind, um Hemmungen automatisch zu erkennen. Methoden mit sekundärer Anreicherung sind eine kluge Wahl für Matrices, die bekanntermaßen eine Herausforderung für die Extraktion oder Amplifikation darstellen. Die Probenvorbereitung kann auch Anpassungen für ölige, zähflüssige oder pulverförmige Lebensmittel erfordern.

Diese Schritte stärken den gesamten Arbeitsablauf und unterstützen eine genaue Entscheidungsfindung.

Die Quintessenz

Partielle Hemmungen sind ein unsichtbarer Faktor bei der Untersuchung von Krankheitserregern, insbesondere bei komplexen oder feuchtigkeitsarmen Lebensmitteln. Sie stoppt nicht immer die Chemie, aber sie kann das Signal, das für den Nachweis einer geringfügigen Kontamination erforderlich ist, unauffällig abschwächen. Durch validierte PCR-Methoden, interne Kontrollen und matrixspezifische Anreicherungsschritte können Labore die Zuverlässigkeit ihrer negativen Ergebnisse verbessern.

In der Molekulardiagnostik bestimmt die Genauigkeit sowohl das Vertrauen als auch die Sicherheit.

Aufruf zum Handeln

Diese Matrizes sind eine Herausforderung und die Risiken sind real. Hygiena® bietet validierte BAX System Q7- und foodproof-Assays an, die eine genaue Entscheidungsfindung bei schwierigen Lebensmitteln, gestressten Zellen und geringfügigen Kontaminationen ermöglichen.

Mit den richtigen Werkzeugen können sich Labore auf die Ergebnisse verlassen, auf die sie sich jeden Tag verlassen.

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

Q: Was ist partielle Hemmung?
Von partieller Hemmung spricht man, wenn Lebensmittelbestandteile die PCR-Amplifikation schwächen, ohne einen vollständigen Reaktionsausfall zu verursachen.

F: Welche Lebensmittel sind am anfälligsten für Inhibition?
Kakao, Schokolade, Nussbutter, Gewürze, Kräuter und fett- oder eiweißreiche Lebensmittel.

F: Kann eine Verdünnung die Hemmung beheben?
Eine Verdünnung kann Hemmstoffe reduzieren, aber auch die Empfindlichkeit verringern. Dies kann dazu führen, dass grenzwertige positive Ergebnisse negativ werden.

F: Warum wird eine sekundäre Anreicherung empfohlen?
Sie hilft gestressten Zellen, sich zu erholen und reduziert die Auswirkungen von Inhibitoren, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen.

F: Wie kann ich eine Hemmung erkennen, bevor sie zu Fehlern führt?
Verwenden Sie Assays mit internen Amplifikationskontrollen, die eine potenzielle Inhibition anzeigen.