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qPCR(Real-Time PCR)协议说明
全面介绍定量聚合酶链式反应(qPCR),又称实时 PCR。该技术广泛用于实验室检测和量化 DNA 和 RNA 序列,在基因表达分析和病原体检测等各种应用中发挥着重要作用。
视频中涉及的要点包括
- qPCR 的原理:该方法扩增特定的 DNA 序列,并使用荧光染料或探针实时测量扩增产物的数量。
- qPCR 的组成部分:
- 模板 DNA/RNA:要扩增的目标序列。
- 引物:启动 DNA 合成的短 DNA 序列。
- DNA 聚合酶:延长引物以形成新 DNA 链的酶。
- 荧光探针/染料:与扩增 DNA 结合时会发出荧光的分子,可用于量化。
- qPCR 工作流程:
- 样品制备:从样品中提取核酸。
- 反应设置:混合模板、引物、聚合酶和荧光探针/染料。
- 热循环:重复变性、退火和延伸循环以扩增目标序列。
- 数据收集:监测每个循环中的荧光强度,对 DNA 进行量化。
- 数据分析:
- 阈值周期(Ct):荧光超过预定阈值的周期数,与目标核酸的初始量成反比。
- 定量方法:标准曲线法和比较 Ct 法确定目标序列的数量。
视频强调了正确实验设计的重要性,包括选择适当的对照和参考基因,以确保获得准确可靠的 qPCR 结果。