Protocolo de qPCR (real-time PCR) explicado

Uma visão geral abrangente da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), também conhecida como real-time PCR. Essa técnica é amplamente usada em laboratórios para detectar e quantificar sequências de DNA e RNA, desempenhando um papel crucial em várias aplicações, incluindo análise de expressão gênica e detecção de patógenos.

Os principais pontos abordados no vídeo incluem:

1. Princípio da qPCR: O método amplifica sequências específicas de DNA e mede a quantidade de produto amplificado em tempo real usando corantes ou sondas fluorescentes.
2. Componentes da qPCR:
   • DNA/RNA de modelo: A sequência-alvo a ser amplificada.
   • Primers: Sequências curtas de DNA que iniciam a síntese de DNA.
   • DNA polimerase: Uma enzima que estende os primers para formar as novas fitas de DNA.
   • Sondas/corantes fluorescentes: Moléculas que emitem fluorescência quando ligadas ao DNA amplificado, permitindo a quantificação.
3. Fluxo de trabalho de qPCR:
   • Preparação da amostra: Extração de ácidos nucleicos da amostra.
   • Configuração da reação: Mistura de modelo, primers, polimerase e sondas/dies fluorescentes.
   • Ciclo térmico: Repetição de ciclos de desnaturação, recozimento e extensão para amplificar a sequência-alvo.
   • Coleta de dados: Monitoramento da intensidade da fluorescência durante cada ciclo para quantificar o DNA.
4. Análise de dados:
   • Ciclo de limiar (Ct): O número do ciclo no qual a fluorescência excede um limite predefinido, inversamente relacionado à quantidade inicial de ácido nucleico alvo.
   • Métodos de quantificação: Curva padrão e métodos comparativos de Ct para determinar a quantidade da sequência-alvo.

O vídeo enfatiza a importância do projeto experimental adequado, incluindo a seleção de controles apropriados e genes de referência, para EnSURE resultados qPCR precisos e confiáveis.