Lehrvideo
qPCR (Real-Time PCR) Protokoll erklärt
Ein umfassender Überblick über die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), auch bekannt als Real-Time PCR. Diese Technik wird in vielen Labors zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA- und RNA-Sequenzen eingesetzt und spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Anwendungen, einschließlich der Genexpressionsanalyse und dem Nachweis von Krankheitserregern.
Die wichtigsten Punkte, die in diesem Video behandelt werden, sind:
- Das Prinzip der qPCR: Die Methode amplifiziert spezifische DNA-Sequenzen und misst die Menge des amplifizierten Produkts in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen oder Sonden.
- Bestandteile der qPCR:
- Vorlagen-DNA/RNA: Die zu amplifizierende Zielsequenz.
- Primer: Kurze DNA-Sequenzen, die die DNA-Synthese einleiten.
- DNA-Polymerase: Ein Enzym, das die Primer verlängert, um die neuen DNA-Stränge zu bilden.
- Fluoreszierende Sonden/Farbstoffe: Moleküle, die Fluoreszenz emittieren, wenn sie an die amplifizierte DNA gebunden sind, was eine Quantifizierung ermöglicht.
- qPCR Arbeitsablauf:
- Probenvorbereitung: Extraktion der Nukleinsäuren aus der Probe.
- Reaktionsaufbau: Mischen von Template, Primern, Polymerase und fluoreszierenden Sonden/Farbstoffen.
- Thermisches Zyklieren: Wiederholte Zyklen von Denaturierung, Annealing und Extension zur Amplifikation der Zielsequenz.
- Datenerfassung: Überwachung der Fluoreszenzintensität während jedes Zyklus, um die DNA zu quantifizieren.
- Analyse der Daten:
- Schwellenwert-Zyklus (Ct): Die Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz einen vordefinierten Schwellenwert überschreitet, der in umgekehrtem Verhältnis zur anfänglichen Menge der Zielnukleinsäure steht.
- Quantifizierungsmethoden: Standardkurve und vergleichende Ct-Methoden zur Bestimmung der Menge der Zielsequenz.
Das Video unterstreicht die Bedeutung einer angemessenen Versuchsplanung, einschließlich der Auswahl geeigneter Kontrollen und Referenzgene, um genaue und zuverlässige qPCR-Ergebnisse zu gewährleisten.